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滤膜法测定总大肠菌群

    1 主题内容与适用范围
    本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。
    本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。
    2 方法提要
   用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，**被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。
    3 培养基与试剂
    3.1 品红亚硫酸钠培养基
    3.1.1 成份
    a 蛋白胨 10g
    b 酵母浸膏 5g
    c 牛肉膏 5g
    d 乳糖 10g
    e 琼脂 15~20g
    f 硫酸氢二钾 3.5g
    g 无水亚硫酸钠 5g左右
    h 碱性品红乙醇溶液(50g/l) 20ml
    i 蒸馏水 1000ml
    3.1.2 储存培养基的制备
   先将琼脂加到500ml蒸馏水中，煮沸溶解，于另500ml蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000ml，混匀后调ph为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，115℃高压**20min，储存于冷暗处备用。
    3.1.3 平皿培养基的配制
   将上法制备的储存培养基加热融化，用**吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于**空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一**试管中，加**水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以**。
   用**吸管吸取已**的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15ml倾入已**的空平皿中。待冷却凝固后置冰箱内备用。此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。
    3.2 乳糖蛋白胨培养基
    3.2.1 成份
    a 蛋白胨 10g
    b 牛肉膏 3g
    c 乳糖 5g
    d 氯化钠 5g
    e 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/l) 1ml
    f 蒸馏水 1000ml
    3.2.2 制法
   将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整ph为7.2~7.4，再加入1ml1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压**20min，贮存于冷暗处备用。
    4 仪器
    4.1 滤器。
    4.2滤膜，孔径0.45~0.65μm。直经根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。
    4.3 抽滤设备。
    4.4 无齿镊子。
    4.5 培养箱: 36±1℃。
    4.6 冰箱: 0~4℃。
    4.7 天平。
    4.8 显微镜。
    4.9 平皿: 直径为9cm。
    4.10 **刻度吸管: 1ml,10ml。
    5 检验步骤
    5.1 准备工作
    5.1.1 滤膜**:
   将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸**三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。
    5.1.2 滤器**: 用点燃的酒精棉球，火焰**。也可用121℃高压**20min。
    5.2 过滤水样
   用无菌镊子夹取**滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放在已**的滤床上、，固定好滤器，将100ml水浴(如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5大气压下抽滤。
    5.3 培养
   水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用**镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基(36.1.3.1)上，滤膜截留**面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养22~24h。
    6 观察结果
    6.1 挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。
    紫红色，具有金属光泽的菌落。
    深红色，不带或略带金属光泽的菌落。
    淡红色，中心色较深的菌落。
   6.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基液，于37℃培养24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。
    6.1.2 计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100ml
                                      水样中的总大肠菌群数报告之(cfu/100ml)
   总大肠菌群菌落数(cfu/100ml)＝───────────────────────………(36－1)
                                          过滤的水样体积(ml)